烟草抗番茄斑萎病毒基因筛选和生物信息学分析,该文是关于生物信息学论文范文，为你的论文写作提供相关论文资料参考。
生物信息学论文参考文献：
摘 要：通过同源克隆的方法在TsWV高感烟草品种NC89、TsWV耐病烟草品种中烟100中分别克隆出一个疑似抗番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）的基因,分别命名为NtSw-5unc89和NtSw-5zy100序列分析表明,NtSw-5vc89长3819bp,包含1个完整的读码框,编码1273个氨基酸,理论等电点和相对分子质量分别为5.64和147529.5Da；NtSw-5zy100长3165bp,包含1个完整的读码框,编码1054个氨基酸,理论等电点和相对分子质量分别为6.75和122032.9Da；NtSw-5nc89和NtSw-5zy100均不含信号肽,均无明显跨膜区,二者均含有大多数植物抗性蛋白所共有的CC-（NB-ARC）-LRR典型结构.系统进化树分析表明,NtSw-5nc89和马铃薯假定晚疫病抗性蛋白同源R1A-3近源关系最近,NtSw-5zy100和烟草假定晚疫病抗性蛋白同源R1A-3同型X2近源关系最近.该结果可为烟草番茄斑萎病毒抗性研究和烟草番茄斑萎病毒的防治提供理论基础.
关键词：烟草：番茄斑萎病毒：抗性基因：生物信息學分析
中图分类号：s435.72
文章编号：1007-5119（2016）04-0060-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.011
近年来,随着农业产业结构的调整以及全球农副产品贸易的频繁,造成众多植物病毒及其媒介昆虫的全球传播和蔓延.番茄斑萎病毒（Tomatospolled will virus,TsWV）正是在这种情况下,随其虫媒介体蓟马（Thrip）进入我国,在我国烟草种植区猖獗危害.种植抗病品种是防治番茄斑萎病最有效的防治措施.当前对TSWV抗性的研究主要集中在番茄和辣椒上,对烟草TSWV的抗性研究较少.已明确有两个抗病基因Sw-5和Sw-7对TSWV具有明显抗性,通过转基因技术或基因渗透（杂交）获得的含Sw-5的植株表现出较强的抗性,但Sw-5对TSWV6、Anwa-1、DaWA-ld和TOTAS一1d等4个株系的TSWV不表现抗性.Sw-7可帮助番茄有效抵御TSWV6和Anwa-1株系的侵染.TSWV在农作物上的暴发流行,除了病毒本身传播介体繁多外,另一个重要的因素是TSWV可以通过基因突变和重组迅速适应并打破寄主抗性.对TSWV基因组变异特征分析表明TSWV的NSs和NP两个蛋白突变导致寄主Tsw基因抗性丧失.国内外对番茄斑萎病毒的抗性品种进行了大量研究,目前可通过小孢子原生质体融合技术,将野生烟草的抗性基因导入栽培品种使其获得抗性,但迄今尚未培育出对番茄斑萎病毒抗性较强的烤烟品种.由于对TSWV的自然抗病基因非常少,筛选工作困难,目前对烟草番茄斑萎病抗性基因的研究比较缓慢,科学家正致力于基因工程手段,将筛选得到的抗性基因经优化表达后导入易染病的栽培烟草基因组中,培育抗病品种.
本研究根据番茄中已确定为抗TSWV基因序列,于烟草全基因组数据库中,通过生物信息学的方法,筛选烟草基因组中疑似抗TSWV的基因,通过同源克隆的方法在TSWV高感品种NC89和TSWV耐病品种中烟100中克隆疑似靶基因.对所获基因进行测序、蛋白结构和功能域预测、蛋白进化分析,推测该基因编码蛋白在细胞中的存在位置、结构和功能以及和其他蛋白的近源关系,为烟草番茄斑萎病毒抗性研究和烟草番茄斑萎病毒的防治提供理论基础.
1.材料和方法
1.1材料
选用烟草品种NC89、中烟100,经田间试验检测NC89为TSWV高感品种,中烟100为TSWV耐病品种.
1.2生物信息学分析及引物设计
于烟草基因组数据库http：//www.pngg.ore,/tgi/pYess release.html中,筛选烟草基因组中和番茄Sw-5基因同源性高的基因,经由序列比对,设计8对引物（表1）,引物由上海生物工程技术公司合成.
1.3种植烟草提取RNA,反转录为eDNA
将烟草NC89、中烟100种植于温室中,保持水分以确保种子发芽率.烟草生长繁盛时期,取叶片液氮速冻,用TIANGENRNAprep purePlantKit提取RNA,invitrogenSuperScriptm First-Strand反转录为eDNA.
1.4 PCR扩增
以NC89、中烟100的eDNA为模板,表1中的引物,用phusionmix和KOD进行扩增.PCR扩增体系：取eDNAlpL,10xbuffer 5pL,10mmoL/LdNTPs4uL,20 pmol/L上下游引物各l pL,TaqDNA聚合酶0.5uL,加ddH20至50uL后进行扩增.PCR循环：94°C预变性5min：94℃30s,57℃30 s,72℃3min30 s,35次循环：最后72℃延伸10 min.PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测.用Promega Wizard SV Gel and PCR Clean-up System进行胶回收纯化.
1.5克隆和测序
PCR产物纯化后克隆到载体pEASY上,并转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞.培养后,进行涂板（培养基含氨苄青霉素）检测,每对引物对应的培养物各挑8个单克隆用rTaq进行菌落PCR阳性检测.将阳性结果送上海生物工程技术公司进行双向测序.
1.6蛋白功能域预测
利用Expasy-ProtParam进行理化性质分析,ExPASy-ProtSeale进行疏水性结构分析,用SignalP4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dlUservices/SignalP/1预测蛋白信号肽,用在线TMHMM Serverv.2.0（htlp：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMMn预测蛋白序列跨膜区,用NCBI-Blast进行结构域预测分析,用Predietprotein进行作用位点分析.
结论：大学硕士与本科生物信息学毕业论文开题报告范文和相关优秀学术职称论文参考文献资料下载，关于免费教你怎么写生物信息学分析方面论文范文。
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