APX基因植物表达双元载体构建转化剑麻,本论文为免费优秀的关于剑麻论文范文资料，可用于相关论文写作参考。
剑麻论文参考文献：
摘 要 剑麻是中国热带地区最重要的麻类经济作物.剑麻H.11648是中国唯一的当家品种,此品种虽高产但易感斑马纹病,而现有的化学农药防效差且病原菌易产生抗性.为了培育出剑麻抗病新品种,以Pcambia3300为基础质粒,构建由35S驱动的APX基因的植物表达载体Pcambia3300-35S-APX-nos,再通过农杆菌EHA105将其导入剑麻中,经PCR扩增后电泳检测分析,结果表明外源基因已整合到受体植物基因组中.
关键词 剑麻；APX基因；斑马纹病；转化
中图分类号 S563.8 文献标识码 A
Abstract Sisal is one of the most important cash crops in the tropical areas of China. Sisal H. 11648 is China’s only variety dorminantly planted. The variety is of high yield but susceptable to zebra grain, and the control effect of chemical pesticides is poor and the pathogens are prone to resistance. In order to breed new sisal disease-resistant varieties, Agrobacterium-mediated APX gene transformation of sisal was tried. On the basis of Pcambia 3300 plasmid, an APX"S plant expression vector Pcambia-3300-APX which driven by 35S was built and transformed to sisal by agrobacterium EHA105. PCR amplification and electrophoresis detection analysis showed that the exogenous gene was integrated into the receptor plant genome.
Key words Sisal；APX；Zebra disease；Transformation
龙舌兰科植物共有21属约670种,龙舌兰麻系是龙舌兰科所属单子叶植物的统称,俗称剑麻,英文名Sisal. 剑麻主要分布于热带、亚热带地区.中国是剑麻的主要生产国之一,中国现在的主栽品种为11648号（Agave hybrid NO.11648,简写为 H.11648）.剑麻H.11648是中国从国外引进的杂交种,虽高产但易感斑马纹病.剑麻斑马纹病是危害剑麻的主要病害之一,由烟草疫霉（Phytophthora nicotianae var. parasitica）引起.1961年坦桑尼亚首先发现此病,中国1970年首次在广东省东方红农场出现此病,1973年暴发流行,此后持续流行,造成严重损失.因烟草疫霉对现存的药剂能够很快的产生耐药性,目前生产上正在使用的杀菌剂很难有效防治斑马纹病,因此急需选育剑麻抗病新种质.剑麻一生只开一次花,开花结果后死亡,其营养生长周期长,一般为10 a,有的甚至长达15 a以上,且花期不一致、花粉不易贮藏、种子发芽率低（一般在10%左右）、F1育性差等特点,从而导致近几十年来通过杂交育种、辐射育种等方法虽然也育成了一些品种,但还未超越H.11648.基因工程育种能够打破物种间的界限,将其他物种中优良的基因导入剑麻中对其进行定向改良.
抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase, 以下简写为APX）广泛存在于各种植物体中.植物体无论是在正常的生物代谢还是在受到生物胁迫或非生物胁迫时都会产生大量的过氧化物,过氧化物若不及时清除会造成植物细胞膜和叶绿体的损伤,甚至造成植物死亡.抗坏血酸过氧化物酶通过清除植物体中的过氧化物来提高植物对生物和非生物胁迫的抵抗能力.张怡[1]通过突变筛选得到APX基因超表达植株,表明APX基因的超表达能够提高植物抵抗环境胁迫的能力.程林梅等[2]和孙卫红等[3]通过将APX基因转入菊苣和烟草中,结果显示转基因植株的抗逆性提高.孙宏丽[4]通过构建反义载体并转入烟草中,得到的转基因植株抗氧化能力降低.蒋明等[5]通过对青花菜APX基因进行RT-PCR分析,结果表明APX基因的表达受霜霉病菌、水杨酸和NaCl诱导.Sarowar等[6-7]将来自于胡椒叶片的抗坏血酸过氧化物酶基因（ascorbate peroxidase-like 1）导入烟草,极大地提高了植物抵抗烟草疫霉的能力, 并在次年发现番茄中的过氧化物酶基因能够抵抗卵菌型的病原体.
鉴于此,本实验拟通过将胡椒叶片中的APX基因插入Pcambia3300载体并转入剑麻中,从而获得既抗剑麻斑马纹病,又抗除草剂的植株.
1 材料和方法
1.1 材料
Pbi121表达载体、Pcambia3300表达载体和农杆菌EHA105均由中国热带农业科学院生物技术研究所张树珍实验室提供,Puc57-APX由本实验室保存.限制性内切酶为fragment公司产品,DNA聚合酶为NEB公司产品,其他产品均由市售分析纯试剂.
1.2 方法
1.2.1 Pcambia3300-APX表达载体的构建 （1）pbi121-APX的构建：设计引物对5′- GCTCTAGAGCA
CGAGGTCGGTTCTCTCTC-3′和5′-TCGAGCTCCCTC
CAAAGTATGGGTATC-3′（引物中下划线部分表示XbaⅠ和SacⅠ酶切位点）,以Puc57-APX载体为模板,PCR扩增获得目的基因APX.上述PCR产物用XbaⅠ和SacⅠ进行双酶切,并利用PCR产物回收试剂盒回收片段.pbi121质粒用XbaⅠ和SacⅠ进行双酶切,电泳后进行胶回收（pbi121回收大片段）.将上述2个片段用T4 DNA连接酶进行连接,热激法转入大肠杆菌中,挑取单克隆进行扩繁,提取质粒进行双酶切验证,挑取阳性克隆送公司测序.
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