木糖筛选系统对杜鹃红山茶愈伤组织诱导与生长的影响,本文是一篇关于杜鹃论文范文，可作为相关选题参考,和写作参考文献。
杜鹃论文参考文献：
摘 要 在农杆菌介导的遗传转化过程中,抗生素不同程度地抑制山茶转化体的生长与分化.以木糖异构酶基因xylA为筛选标记,试图建立杜鹃红山茶（Camellia azalea）遗传体系过程中的非抗生素筛选系统.从大肠杆菌Top10中扩增出xylA基因,并用其替换经改造的植物表达载体pCAMBIA1300中的hptⅡ基因,获得植物表达载体pCAMBIA1300-xylA并导入根癌农杆菌EHA105中,经农杆菌介导转化烟草结果表明,xylA标记基因可以替代卡那霉素应用于烟草转化体中,且效果更优.以杜鹃红山茶带柄叶片、茎段、子叶为外植体诱导的愈伤组织,生长状态均表现良好,愈伤组织启动诱导的所需天数比对照组提前约10 d,生长量为对照组的1.5～2.5倍.可以认为25 g/L的木糖浓度是适合杜鹃红山茶愈伤组织诱导及生长的筛选浓度.
关键词 杜鹃红山茶；愈伤组织；诱导；生长；木糖筛选
中图分类号 S685.14 文献标识码 A
杜鹃红山茶（Camellia azalea）自然分布于广东省阳春市鹅凰嶂自然保护区,四季着花,夏季盛花,花色艳丽,是中国特有的山茶遗传种质,也是培育四季茶花新品种的特异亲本.杜鹃红山茶的杂交育种已取做到突破性进展[1-2].通过分子生物学技术将不同功能的外源基因导入杜鹃红山茶中,以加速培育抗逆性强的杜鹃红山茶特异新品种势将成为新的发展趋势之一.然而,山茶属植物离体再生困难,转化效率低,最终转基因成功的报导极少,仅山茶属的茶树（Camellia sinensis）通过农杆菌介导法和卡那霉素（Kanamycin）筛选体系成功获得转基因植株[3].范正琪等[4]发现卡那霉素、潮霉素（Hygromycin）对山茶愈伤组织诱导及生长有较大的影响,抗生素浓度较高时,愈伤组织容易褐变,分化状态不佳,因此未能获得再生植物.转基因桃及杨树的实验中也发现较高浓度的卡那霉素会抑制转基因植株的再生甚至完全抑制芽的分化[5-6].
1996年Joersbo等[7]发现糖基因参与的正向选择系统可以解决植物组织对抗生素敏感的问题,其中木糖异构酶基因（xylose isomerase,xylA）通过编码的木糖异构酶,将木糖转变为植物可利用的木酮糖,从而达到筛选细胞的作用[8-10].目前木糖筛选系统已在玉米、花生及黄瓜等植物中获得成功[11-13],然而将此系统应用于山茶方面的研究尚未见报道.
笔者以杜鹃红山茶带柄叶片、茎段、子叶为外植体,以木糖为筛选系统,研究其对杜鹃红山茶不同外植体愈伤组织诱导及植株再生的影响,为优化杜鹃红山茶高效稳定的遗传转化体系提供科学依据.
1 材料与方法
1.1 材料
以烟草及杜鹃红山茶带柄叶片、茎段及子叶为组培材料.农杆菌EHA105、pCAMBIA1300载体为本实验保存,大肠杆菌Top10感受态细胞购自北京全式金生物有限公司,大肠杆菌DH5α购自宝生物工程（大连）有限公司.
1.2 方法
1.2.1 大肠杆菌xylA基因的扩增 大肠杆菌Top10基因组DNA提取参照试剂盒说明书进行.根据GenBank中登录的xylA基因序列（GenBank登录号：X04691）设计引物,上下游引物5" 端添加XhoⅠ酶切位点.F1：5′-CCGCTCGAGATGCAAGCCTATTT
TGACC-3′；R1：5′-CCGCTCGAGTTATTTGTCGAA
CAGATAA-3′.以大肠杆菌Top10基因组DNA为模板,高保真酶扩增xylA基因全长.
1.2.2 植物表达载体pCAMBIA1300-xylA构建
用XhoⅠ酶分别酶切pCAMBIA1300和pGEM-T-xylA,回收pCAMBIA1300载体大片段和pGEM-T-xylA的小片段,T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接大小片段.XhoⅠ酶切检验xylA是否插入,PCR检测插入片段的方向.检测引物为CaMV35S promoter末尾端的一段序列及CaMV35S polyA初始端的一段序列,分别为F2：5′-GATGTGATATCTCCACTG
ACG-3′；R2：5′-AGCTTGTCGATCGACAGATC-3′.
1.2.3 xylA基因在模式植物中的功能鉴定 将pCAMBIA1300-xylA转化到根癌农杆菌EHA105中,利用改良的Horsch“叶盘法”转化烟草[14],外植体为生长旺盛的烟草无菌苗叶片,将其剪成1 cm×1 cm的叶盘,无需预培养,直接进行农杆菌侵染15 min,无菌水冲洗5次,共培养2 d后,转至诱导培养基中进行愈伤组织诱导.其培养基组分为：MS（30 g/L蔗糖）+2.25 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+6.5 g/L植物琼脂,愈伤组织诱导及分化培养基为：MS（15 g/L蔗糖+15 g/L木糖）+2.25 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+6.5 g/L植物琼脂+200 mg/L Tim （特美汀,Timentin）,不定芽生根培养基为：1/2 MS（15 g/L蔗糖+15 g/L木糖）+6.5 g/L植物琼脂+200 mg/L Tim[11-13,15].对照组为空载体pCAMBIA1300转EHA105,共培养基同实验组,愈伤组织诱导、分化培养基及不定芽生根培养基中碳源为30 g/L蔗糖,另外添加50 mg/L Kan,其余组分同实验组.每组50个叶盘,重复3次.
观察烟草遗传转化过程中木糖对转化体的影响,统计愈伤诱导率、不定芽及生根数量,检测并统计转基因烟草阳性转化率,其中PCR检测引物实验组为xylA基因全长上下游引物：F3：5′-ATG
CAAGCCTATTTTGACC-3′,R3：5′-TTATTTGTCGA
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